De bacteriële uitstrijkje is een dunne film verlenging van een suspensie van bacteriële micro-organismen die wordt gemaakt op een transparante glazen plaat of objectglaasje, voor observatie onder een optische microscoop.
De verlenging in de vorm van een film wordt uitgevoerd om de micro-organismen zoveel mogelijk te scheiden, aangezien de waarneming niet duidelijk is als ze gegroepeerd zijn.
Bij de studie van bacterieculturen worden uitstrijkjesvoorbereiding, fixatie- en kleuringstechnieken gebruikt om ze beter te analyseren. Vanwege de kleine omvang van micro-organismen is het gebruik van een optische microscoop noodzakelijkerwijs vereist voor hun waarneming..
Optische microscopen zijn onmisbare instrumenten voor het observeren van uitstrijkjes. Deze maken gebruik van optische lenzen en licht waardoor de monsters met een grote vergroting kunnen worden bekeken..
Over het algemeen hebben levende cellen niet voornamelijk gekleurde structuren, gezien met de lichtmicroscoop zijn het kleurloze, transparante monsters, en ze vertonen zeer weinig intern contrast en met hun omgeving..
Waarneming met de eenvoudige optische microscoop met heldere velden, zonder het gebruik van hulpkleuringstechnieken, is zeer beperkt en wordt slechts in sommige gevallen gebruikt, zoals bij het waarnemen van de beweging van micro-organismen.
Voor een optimale waarneming van micro-organismen moet een balans worden gevonden tussen contrast en resolutie. Celdetails zijn niet zichtbaar onder de microscoop, zelfs niet met een hoge resolutie; het gebruik van kleurstoffen is vereist door middel van kleurtechnieken, die zorgen voor contrast voor observatie.
Artikel index
Om een uitstekend contrast te bereiken, worden er geavanceerde microscopen genoemd fasecontrastmicroscoop, differentiële interferentiemicroscoop en donkerveldmicroscoop. Dit type microscoop wordt gebruikt om bacteriële structuren zoals onder meer omhulsels en filamenten te observeren..
Kleuring is een eenvoudige techniek om het contrast te verhogen dat wordt bereikt met een helderveldmicroscoop. Bij deze techniek kunnen verschillende kleurstoffen worden gebruikt die de microscopische waarneming aanzienlijk verbeteren..
De vlekken worden rechtstreeks op de uitstrijkjes of verlengstukken van de suspensies van micro-organismen op de objectglaasjes aangebracht, vooraf gedroogd en gefixeerd..
Fixatie is een techniek die wordt gebruikt om celstructuren te behouden; veroorzaakt inactivering van micro-organismen en hechting aan het glas van het objectglaasje. Er zijn verschillende fixatiebehandelingen: warmtefixatie en chemische fixatie.
Dit is de meest gebruikte methode om bacteriële uitstrijkjes te observeren. De techniek bestaat erin de bacteriële suspensie van het uitstrijkje door de vlam van een aansteker te laten gaan. Deze techniek is in staat om de externe morfologie van bacteriën te behouden, maar vernietigt hun interne structuren..
Bij chemische fixatie worden conserveringsmiddelen gebruikt, zoals onder andere formaldehyde of formaldehyde, ethanol en azijnzuur. Het voordeel van het gebruik van chemische fixatiemiddelen is dat het behoud van de interne celstructuren van de micro-organismen wordt bereikt..
De meest gebruikelijke procedures voor het kleuren van een eerder gedroogd en gefixeerd uitstrijkje zijn positieve of eenvoudige kleuring, differentiële kleuring en negatieve kleuring. Er zijn ook speciale technieken voor het kleuren van bepaalde celstructuren (capsule, sporen, flagella).
Positieve of eenvoudige kleuring is de meest gebruikte vlekkleuringstechniek. Het maakt gebruik van kleurstoffen die zich kunnen binden aan bepaalde microbiële structuren, waardoor ze onder een microscoop kunnen worden waargenomen.
Deze kleurstoffen hebben chromofoorgroepen (gekleurd gedeelte) in hun chemische structuur, met afwisselende dubbele bindingen en enkele bindingen (conjugatie). Deze bindingen kunnen op hun beurt ionische of covalente bindingen tot stand brengen met sommige cellulaire structuren..
De vlekken die worden gebruikt bij positieve of eenvoudige kleuring zijn meestal chemische derivaten van de aniline (gekleurde organische zouten).
Aan de andere kant kunnen we onder de kleurstoffen sommige vinden met een basische pH en andere met een zure pH..
In basiskleurstoffen heeft de chromofoorgroep een positieve elektrische lading. De overgrote meerderheid van prokaryote micro-organismen heeft een neutrale interne pH en hun celoppervlak is negatief geladen. Door deze elektrostatische interactie bindt de chromofoor zich aan de cel en kleurt deze.
Voorbeelden van basische kleurstoffen zijn onder andere methyleenblauw, kristalviolet, malachietgroen, basisch fuscin, safranine..
In zure kleurstoffen heeft de chromofoorgroep een negatieve elektrische lading. Deze worden gebruikt om eiwitten te kleuren met positief geladen aminogroepen. Voorbeelden van zure kleurstoffen zijn zure fuscine, Bengaalse roos, Congo rood en eosine.
De differentiële kleuringstechniek bestaat uit het aanbrengen van twee kleurstoffen van verschillende kleur of intensiteit om verschillende micro-organismen onder de microscoop te onderscheiden. Gramkleuring en zuur-alcoholbestendige kleuring zijn de meest gebruikte differentiële kleuringen in de bacteriologie.
De Gramkleuring wordt gebruikt als een voorlopige test om de vorm, grootte, celgroepering en het type celwand te kennen. Met behulp van de Gramkleuringstest worden celwandbacteriën ingedeeld in Grampositieve bacteriën en Gramnegatieve bacteriën..
Bij deze techniek worden chemische kleurstoffen gebruikt die niet het celinterieur binnendringen, maar het medium waarin de micro-organismen zich bevinden, als een zwarte achtergrond laten verschijnen..
Bij de negatieve kleuringstechniek wordt het uitstrijkje gemaakt met een druppel Oost-Indische inkt of nigrosinesuspensie, die na drogen bij kamertemperatuur een film vormt die ondoorzichtig is voor de doorgang van licht. Op deze manier worden micro-organismen gezien als heldere vormen op een donkere achtergrond..
1.- Was de dia's zeer goed, droog ze met absorberend papier en label ze. Op het etiket moet de inhoud van het preparaat staan, de datum en de naam van de persoon die het heeft verwerkt..
2.- Steek de aansteker aan en steriliseer de inoculatielus in de vlam tot hij helderrood is.
3.- Laat het handvat afkoelen.
4.- Neem de bacteriekweekbuis, verwijder de dop en ga snel langs de opening van de buis nabij de brandervlam (vlam).
5.- Steek de inoculatielus in de buis met de bacteriecultuur en neem het monster.
6.- Als de cultuur in vloeibaar medium is, plaats het monster dat met het handvat is genomen in het midden van het objectglaasje en verdeel het voorzichtig in een cirkel met een diameter van ongeveer 2 cm..
7.- Steriliseer de inoculatielus opnieuw.
8.- Laat het uitstrijkje aan de lucht drogen.
9.- Herhaal stap 3 t / m 8 driemaal.
10.- Als de cultuur in vast medium is, moet vooraf een druppel gedestilleerd water op het objectglaasje worden geplaatst. Dit wordt gedaan om een klein monster van de kweek die is genomen met de inoculatielus te mengen, zoals aangegeven in stap 2 tot 5 (aseptische omstandigheden).
11.- Verspreid het verdunde monster met de druppel water op het objectglaasje en herhaal dit driemaal.
1.- Voeg twee druppels methanol of absolute ethanol toe aan de droge uitstrijkjes van culturen in vloeibaar medium..
2.- Laat aan de lucht drogen, weg van de aansteker.
3.- Als het uitstrijkje afkomstig is van een cultuur op vast medium, wordt het droge uitstrijkje met warmte gefixeerd, waarbij het 2 tot 3 keer snel door het heetste deel van de aansteker wordt geleid..
4.- Raak het onderste deel van het uitstrijkje aan met het dorsale deel van de linkerhand (voor rechtshandigen; gebruik anders de rechterhand) en controleer of het koud is.
1.- Voeg 2 druppels van de geselecteerde vlek toe aan het uitstrijkje en laat het inwerken gedurende de tijd die vereist is in de specifieke protocollen voor elke vlek (doorgaans tussen 1 en 5 minuten).
2.- Sommige vlekken vereisen het gebruik van warmte om ze te activeren, in welk geval men heel voorzichtig moet zijn bij het verwarmen van het objectglaasje in de lichtere vlam (manipuleer het met een pincet en voorkom koken). Een oververhitting van het uitstrijkje kan de te observeren cellen vernietigen..
3.- Verwijder overtollige kleurstof door te wassen met gedestilleerd water uit een picette. Verwijder het waswater door zachtjes met de glijbaan op de rand te tikken, gekanteld op de werktafel.
4.- Laat drogen aan de lucht.
5.- Afhankelijk van het type waarneming wordt in dit stadium al dan niet een dekglaasje gebruikt. Het dekglaasje beschermt en behoudt het uitstrijkje. Als in dit stadium een olie-immersie-observatie wordt gemaakt, worden geen dekglaasjes gebruikt, maar het uitstrijkje kan niet worden bewaard.
1.- Dompel het uitstrijkje achtereenvolgens gedurende minimaal 5 minuten onder in elk van de hieronder aangegeven oplossingen. Het doel van deze "baden" is om het uitstrijkje volledig uitgedroogd te laten. Elk reagens moet goed worden afgetapt voordat het uitstrijkje in het volgende bad wordt aangebracht..
De volgorde van de dehydratatiebaden is als volgt:
Daarna aan de lucht laten drogen.
2.- Monteer het dekglaasje, bij voorkeur 22 × 22 mm, met Canada-balsem of een ander afdekmedium.
Niemand heeft nog op dit artikel gereageerd.