De immunofluorescentie is een krachtige immunokleuringstechniek die antilichamen gebruikt die covalent zijn gekoppeld aan fluorescerende moleculen om specifieke doelen te identificeren in celmonsters die op een vaste drager zijn gefixeerd.
Deze techniek omvat microscopische observatie met immunologische specificiteit, waardoor het mogelijk wordt om levende of dode cellen te observeren die minuscule hoeveelheden antigenen kunnen bevatten. Het wordt veel gebruikt, zowel op het gebied van onderzoek als bij de klinische diagnose van verschillende pathologieën.
Deze techniek, voornamelijk kwalitatief (met enkele kwantitatieve varianten), heeft specifiek te maken met de visualisatie van een monster door het productsignaal van een fluorofoor, een fluorescerend molecuul dat is gebonden aan een antilichaam en dat kan worden geëxciteerd bij een bepaalde golflengte. ..
In de cellulaire context is het erg nuttig om de aan- / afwezigheid en subcellulaire locatie van eiwitten te bestuderen. De techniek werd in de beginperiode in de klinische setting gebruikt voor de diagnose van virussen zoals influenza en vervolgens voor vele andere infectieziekten..
Het is een zeer gevoelige techniek en met de juiste microscopie-apparatuur kan het een zeer goede resolutie hebben. Het vereist, voor zijn waarneming, het gebruik van confocale of epifluorescentiemicroscopen.
Ondanks het feit dat het erg populair is, kan het enkele belangrijke problemen opleveren met betrekking tot het verkrijgen van niet-specifieke fluorescentie die wat achtergrondruis genereert, wat vaak het goed aflezen van de resultaten beperkt..
Artikel index
Immunofluorescentie is gebaseerd op het benutten van het biologische fenomeen van de interactiereactie tussen een antilichaam en een antigeen. Het heeft specifiek te maken met de visualisatie of detectie van deze reactie door fluorescerende moleculen op een specifieke golflengte te exciteren.
Een antilichaam is een immunoglobuline-eiwit dat wordt uitgescheiden door actieve B-cellen en dat specifiek wordt gegenereerd tegen een antigeen waaraan het zich met grote affiniteit en specificiteit kan binden. Immunofluorescentie maakt gebruik van IgG-immunoglobulinen, die oplosbaar zijn in bloedserum..
Antilichamen zijn moleculen tot 950 kDa die zijn samengesteld uit twee korte (lichte) en twee lange "Y" -vormige (zware) peptideketens. Zowel lichte als zware ketens zijn verdeeld in twee domeinen: een variabele, die het antigeen kan herkennen, en een andere constante of geconserveerde, kenmerkend voor elke soort..
Antigenen worden functioneel gedefinieerd als moleculen die kunnen worden herkend door een antilichaam en zijn meestal eiwitten. Wanneer een dier wordt blootgesteld aan een antigeen, worden de lymfocyten van het immuunsysteem geactiveerd, waardoor er specifieke antilichamen tegen het dier worden aangemaakt en die functioneren als een afweersysteem..
Een antigeen, zoals een eiwit, kan bijvoorbeeld meer dan één epitoop of herkenningsplaats door een antilichaam hebben, dus het serum van het dier dat aan een antigeen wordt blootgesteld, kan polyklonale antilichamen hebben tegen verschillende regio's van hetzelfde eiwit..
Immunofluorescentie maakt dan gebruik van het vermogen van een dier om polyklonale antilichamen tegen een specifiek antigeen te produceren om het te zuiveren en vervolgens te gebruiken voor de detectie van hetzelfde antigeen in andere contexten..
Tot de fluorescerende kleurstoffen of moleculen die het meest worden gebruikt voor sommige immunofluorescentietechnieken behoren fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC), tetramethylrhodamine-isothiocyanaat-5 en 6 (TRITC), veel cyanines zoals Cy2, Cy3, Cy5 en Cy7 en kleurstoffen genaamd Alexa Fluor®, zoals Alexa Fluor® 448.
Het immunofluorescentieprotocol varieert afhankelijk van vele factoren, maar omvat in algemene termen een lineaire opeenvolging van stappen, bestaande uit:
De voorbereiding van de monsters hangt af van hun aard en het soort ervaring dat moet worden uitgevoerd. Vervolgens wordt het eenvoudigste geval uitgelegd, waarbij cellen in suspensie worden gebruikt..
Cellen in suspensie, dat wil zeggen in een vloeibaar kweekmedium, moeten er eerst door centrifugeren van worden gescheiden en vervolgens worden gewassen met een bufferoplossing of "buffer" isosmotisch, met behoud van zijn integriteit.
Normaal gesproken wordt een fosfaat-zoutbuffer gebruikt, bekend als PBS, waarin de cellen worden geresuspendeerd en dit mengsel opnieuw wordt gecentrifugeerd om de cellen vrij te maken van het kweekmedium dat storende stoffen kan bevatten..
De objectglaasjes die worden gebruikt voor microscopische observatie, waar de cellen later zullen worden gefixeerd voor de overeenkomstige stroomafwaartse behandelingen, moeten ook zorgvuldig worden voorbereid..
Deze worden bedekt of "gesensibiliseerd" met een oplossing van polylysine, een synthetisch polymeer dat zal werken als een "moleculaire lijm" tussen de cellen en de vaste drager, dankzij de elektrostatische interactie tussen de positieve ladingen van hun aminogroepen en de cellen. negatieve ladingen op de eiwitten die cellen omhullen.
Dit proces bestaat uit het immobiliseren van de eiwitten in de cel om hun ruimtelijke locatie intact te houden. De gebruikte moleculen moeten alle soorten celmembranen kunnen passeren en roosters kunnen vormen met covalente eiwitten..
Formaldehyde en paraformaldehyde, glutaaraldehyde en zelfs methanol worden veel gebruikt, waarmee celmonsters een bepaalde tijd worden geïncubeerd en vervolgens worden gewassen met een isosmotische bufferoplossing.
Na het fixeren van de cellen worden ze verder vastgemaakt aan de vellen die eerder met polylysine waren gesensibiliseerd..
Afhankelijk van het type test dat wordt uitgevoerd, zal het nodig zijn om de cellen die worden bestudeerd te permeabiliseren of niet. Als men de locatie, aan- of afwezigheid van een bepaald eiwit op het celoppervlak wil weten, is permeabilisatie niet nodig.
Aan de andere kant, als u de locatie van een eiwit in de cel wilt weten, is permeabilisatie essentieel en zal deze bestaan uit het incuberen van de monsters met Triton X-100, een detergent dat celmembranen kan permeabiliseren..
Een fundamentele stap in alle immunologische technieken is het blokkeren. In dit stadium van de procedure bestaat het blokkeren uit het bedekken, in de gesensibiliseerde vellen, van alle plaatsen met polylysinemoleculen waaraan cellen niet hechten. Dat wil zeggen, het voorkomt elke niet-specifieke unie.
Normaal gesproken worden voor het blokkeren van oplossingen met runderserumalbumine (BSA) in PBS-buffer gebruikt en de beste resultaten worden verkregen naarmate de incubatietijd met deze oplossing langer is. Na elke stap, inclusief het blokkeren, is het nodig om de resterende oplossing af te spoelen..
De immunokleuring of immunokleuring procedure zal voornamelijk afhangen van of het een directe of indirecte immunofluorescentie is (zie hieronder)..
Als het een primaire of directe immunofluorescentie is, worden de monsters geïncubeerd met de gewenste antilichamen, die moeten worden gekoppeld aan de fluorescerende kleurstoffen. De incubatieprocedure bestaat uit het maken van een verdunning van het antilichaam in een oplossing die ook BSA zal bevatten, maar in een lagere verhouding.
Als het een secundaire of indirecte immunofluorescentie betreft, moeten twee opeenvolgende incubaties worden uitgevoerd. Eerst met de gewenste antilichamen en daarna met de antilichamen die de constante gebieden van de primaire immunoglobulinen kunnen detecteren. Het zijn deze secundaire antilichamen die covalent zijn gebonden aan fluoroforen..
De techniek is zeer veelzijdig en maakt gelijktijdige labeling van meer dan één antigeen per monster mogelijk, zolang er in het geval van directe immunofluorescentie primaire antilichamen zijn gekoppeld aan verschillende fluoroforen..
Voor gelijktijdige labeling bij indirecte immunofluorescentie is het noodzakelijk ervoor te zorgen dat elk primair antilichaam wordt geproduceerd in een ander dier, en dat elk secundair antilichaam is gekoppeld aan een andere fluorofoor..
Net als blokkeren, geeft incubatie met antilichamen betere resultaten naarmate de incubatietijd langer is. Na elke stap is het nodig om de overtollige antilichamen die niet aan de monsters zijn gebonden weg te wassen en in de secundaire immunofluorescentie is het noodzakelijk om te blokkeren voordat het secundaire antilichaam wordt toegevoegd.
Bepaalde technieken gebruiken andere kleuringen die geen verband houden met immunokleuring, zoals het kleuren van nucleair DNA met de DAPI-fluorofoor..
Tijdens de laatste incubatietijd met de fluoroforen is het noodzakelijk dat de monsters in het donker blijven. Voor microscopische observatie is het gebruikelijk om sommige stoffen te gebruiken om de fluorescentie van de fluoroforen gekoppeld aan de antilichamen te behouden..
Het heeft te maken met de detectie van antigenen door het gebruik van fluorescerende antilichamen. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van deze techniek is de snelheid, maar er kunnen veel gevallen van niet-specifieke binding optreden tijdens het proces, vooral bij het bestuderen van menselijke sera, omdat ze rijk zijn aan zeer heterogene antilichamen..
Het staat ook bekend als de "sandwich" -techniek en hierbij wordt de techniek in twee stappen ontwikkeld. De eerste heeft te maken met het gebruik van een niet-fluorescerend antilichaam en de binding ervan aan het antigeen van belang..
Tegen het constante gebied van dit eerste antilichaam (dat nu als antigeen zal dienen) wordt een tweede antilichaam gebruikt dat het kan herkennen, dat is geassocieerd met een fluorescerend molecuul.
Het verschijnen van een fluorescerend signaal zal het resultaat zijn van specifieke herkenning tussen het eerste niet-fluorescerende antilichaam en het antigeen van belang; de aanwezigheid van dit eerste antilichaam bepaalt dat van het tweede, dat gelabeld is en waardoor de aan- of afwezigheid van het antigeen kan worden bepaald.
Ondanks dat het een veel meer tijdrovende techniek is dan directe immunofluorescentie (aangezien het nog een incubatiestap omvat), omvat deze techniek niet het ontwerp van een fluorescerend antilichaam voor elk antigeen dat wordt bestudeerd, wat economisch gezien levensvatbaarder is..
Bovendien is het een gevoeliger techniek in termen van signaalversterking, aangezien meer dan één secundair antilichaam kan binden aan het constante gebied van het primaire antilichaam, waardoor de intensiteit van het fluorescentiesignaal wordt versterkt..
Zoals eerder opgemerkt, is immunofluorescentie een uiterst veelzijdige techniek, die op wetenschappelijk en klinisch gebied een veelvoud aan toepassingen heeft gekregen. Het kan worden gebruikt om ecologische, genetische en fysiologische vragen over veel organismen te beantwoorden.
Onder de klinische toepassingen wordt het gebruikt voor de directe diagnose van sommige dermatologische aandoeningen, hetzij met behulp van directe of indirecte immunofluorescentie op epitheelweefsel van de bestudeerde patiënten..
Immunofluorescentietechnieken zijn beschikbaar in eencellige organismen zoals gist om intranucleaire en cytoplasmatische microtubuli, actine en geassocieerde eiwitten, 10 nm filamenten en andere bestanddelen van het cytoplasma, membraan en celwanden zichtbaar te maken..
Niemand heeft nog op dit artikel gereageerd.