De coagulase-test het is een laboratoriumtechniek die wordt gebruikt om de aanwezigheid van het coagulase-enzym aan te tonen. Dit enzym heeft de eigenschap plasma te coaguleren. Loeb was in 1903 de eerste die dit enzym beschreef.
Deze test wordt uitgevoerd op Gram-positieve kokken, catalase-positief, waardoor de stammen van kunnen worden onderscheiden Staphylococcus aureus van de rest van de stafylokokken, omdat het het enige micro-organisme van klinisch belang is dat het produceert.
In die zin worden leden van de Staphylococaceae-familie die negatief testen, vaak coagulase-negatieve Staphylococcus genoemd..
Er zijn een aantal verschillende soorten S. aureus die coagulase kunnen produceren, zoals Staphylococcus schleiferi spp coagulans, S. hyicus, S. intermedius en S. delphini.
De eerste drie zijn echter van klinisch belang op veterinair niveau en kunnen zeer zelden worden gevonden als veroorzaker van infecties bij mensen, terwijl S. delphini het wordt alleen in maritieme omgevingen aangetroffen.
Bovendien zijn ze gemakkelijk te onderscheiden omdat S. hyicus Y S. intermedius fermenteer geen mannitol en S. schleiferi spp coagulans fermenteert geen maltose, noch trehalose, terwijl S. aureus fermenteert deze koolhydraten.
De aanwezigheid van het coagulase-enzym is in verband gebracht met de virulentie van de stammen. Deze theorie is echter uit elkaar gevallen, gezien het feit dat andere virulente coagulase-negatieve soorten worden waargenomen die in staat zijn om belangrijke infecties te veroorzaken..
Artikel index
Staphylococcus aureus produceert twee soorten coagulase, een die aan de celwand blijft vastzitten, ook wel agglutinatiefactor of reactieve coagulase factor (CRF) genoemd, en een extracellulair dat vrijkomt in vloeibare culturen. Daarom worden ze respectievelijk gebonden coagulase en vrije coagulase genoemd..
Het coagulase-enzym dankt zijn naam aan de werking die het produceert. Dit heeft het vermogen om fibrinogeen om te zetten in fibrine, waardoor een duidelijk stolsel ontstaat wanneer het in plasma wordt aangetroffen, dat wil zeggen, dit enzym simuleert de activiteit van trombine in de stollingscascade..
In feite is een van de meest algemeen aanvaarde theorieën dat gebonden coagulase reageert met vrije coagulase om stollingsfactoren te activeren. Deze activering genereert een stof die op dezelfde manier werkt als protrombine, waardoor een verbinding ontstaat met de functie van trombine..
Het verschil met de normale coagulatiecascade is dat deze reactie de aanwezigheid van calcium niet vereist en niet wordt beïnvloed door heparine..
Om de coagulase-test uit te voeren, is het voldoende om een verse kweek van Staphylococcus onder ogen te zien met een bij voorkeur konijnenplasma en dus de vorming van het stolsel te observeren of niet.
Er zijn specifieke technieken om gebonden coagulase en gebonden en vrije coagulase tegelijkertijd te detecteren..
Sommige soorten S. aureus ze geven sneller een positief resultaat dan andere. De snelheid van stolselvorming is recht evenredig met de aanwezige concentratie coagulase..
De glaasjes coagulase-test detecteert gebonden coagulase en de buis-test detecteert zowel gebonden als vrije coagulase.
-Schone dia
-Konijnenplasma kan bij voorkeur ook menselijk of paardenplasma worden gebruikt. Plasma kan commercieel gelyofiliseerd en gereconstitueerd worden gekocht voor gebruik, of het kan vers (vers) worden gebruikt. Een ander levensvatbaar alternatief is het gebruik van fibrinogeen.
-Steriele zoutoplossing (0,85%) (SSF).
Teken veneus menselijk of dierlijk bloed. Elk van de volgende anticoagulantia kan worden gebruikt: EDTA, calciumoxalaat, heparine of natriumcitraat. Meng goed en centrifugeer. Verwijder aseptisch het supernatant (plasma), zonder rode bloedcellen, en plaats het in een steriele buis.
Reconstitueer zoals aangegeven op de injectieflacon uit de in de handel verkrijgbare kit.
Gebruik citraatplasma en meng het plasma in gelijke delen met een verzadigde natriumchlorideoplossing. Laat neerslaan en centrifugeer.
Gooi het supernatant weg, reconstitueer het neerslag tot 5 keer zijn volume met steriel gedestilleerd water. Voeg 5 eenheden heparine toe voor elke ml fibrinogeen. Bewaar in een steriele buis.
Een druppel zoutoplossing en een druppel plasma worden afzonderlijk op een objectglaasje geplaatst. Neem met de platina lus 1 of 2 zuivere kolonies van het te testen micro-organisme.
Meng de bacteriële lading in de plasmadruppel en herhaal de bewerking op de SSF-druppel. Bekijk de resultaten onmiddellijk. Een positief resultaat zal er een zijn waarin de vorming van een macroscopisch agglutinaat (wit neerslag) wordt waargenomen na één minuut aan de kant van de druppel met plasma..
De SSF-drop dient als een negatieve controle. Als agglutinatie wordt waargenomen met SSF, betekent dit dat het micro-organisme zelfagglutineert, wat vals-positieve resultaten kan geven. In dit geval moet het worden bevestigd met de buistest.
Het wordt ook aanbevolen om een positieve controle te monteren met een bekende stam van S. aureus.
Agglutinatie binnen 5-20 seconden (sterk positieve test).
Variabele agglutinatie die optreedt tussen 20 seconden en één minuut (vertraagde positieve test).
Enige mate van agglutinatie na één minuut (twijfelachtig bewijs). Het wordt aanbevolen om de test te herhalen of te bevestigen met de buismethode.
Geen agglutinatie (negatieve test).
Resultaat met SSF. Het moet altijd negatief zijn, als het automatisch positief is, wordt het testresultaat ongeldig.
-Steriele reageerbuis
-Plasma
-Waterbad op 37 ° C.
Pipetteer 0,5 ml plasma in een 12 x 75 reageerbuis met een steriele pipet.Laad de platina-lus met 2 tot 4 zuivere kolonies om 18 tot 24 uur uit een vaste kweek te bestuderen en los op in het plasma, meng en incubeer voorzichtig bij 37 ° C gedurende 4 uur.
Onderzoek de buis in het eerste uur zonder hem te schudden, kantel hem gewoon voorzichtig. Als er nog steeds geen stolsel wordt gezien, kan dit elke 30 minuten worden waargenomen totdat de 4 uur voorbij zijn. Als het na 4 uur nog steeds negatief is, kan het maximaal 24 uur op kamertemperatuur worden bewaard. Observeer en rapporteer het resultaat.
Op basis van ervaring raden sommige microbiologen aan om 500 µl van een bacteriesuspensie uit een 18-uurskweek in vloeibaar medium te gebruiken om de test uit te voeren..
Het lijkt snellere en betrouwbaardere resultaten te bieden dan bij het emulgeren van kolonies uit vaste media, vooral als menselijk plasma is gebruikt dat is verkregen uit de bloedbank..
Het gebruik van stammen uit een bouillon helpt de mogelijke aanwezigheid van menselijke anti-stafylokokken-antilichamen in het plasma te verdunnen die de werking van coagulase kunnen remmen..
Als een stolsel wordt gezien dat alle vloeistof omvat (volledige stolling) of stolsel met niets in de resterende vloeistof (gedeeltelijke stolling), moet dit als een positieve test worden beschouwd..
Als er geen stolsel wordt gevormd, dat wil zeggen dat de suspensie homogeen blijft, is de test negatief.
Fibrinogeen wordt op dezelfde manier gebruikt als plasma en wordt zowel voor de objectglaasjes als voor de buisjes gebruikt. Ga te werk zoals beschreven voor plasma en interpreteer op dezelfde manier.
Het wordt gebruikt om de Staphylococcus aureus van coagulase-negatieve stafylokokken.
Heb verse culturen van een soort van S. aureus om als positieve controle te worden gebruikt. Een soort van S. epidermidis als negatieve controle.
-Een positieve test mag niet gedurende 24 uur in incubatie worden gelaten, aangezien de S. aureus produceert een fibrinolysine dat het stolsel oplost.
-Voor een betrouwbare test moet vers of nieuw gereconstitueerd plasma worden gebruikt, en het is ook belangrijk om verse bacterieculturen te gebruiken (18 tot 24 uur). Dit voorkomt valse negatieven.
-De test moet worden uitgevoerd in combinatie met een negatieve en een positieve controle.
-Sommige vaste media kunnen de coagulase-test verstoren. Het wordt niet aanbevolen om kolonies van zoute mannitol-agar te gebruiken.
-Als gecitreerd plasma wordt gebruikt, wordt aanbevolen om 5 eenheden heparine per ml plasma te plaatsen om vals-positieven te voorkomen. Dit komt doordat sommige micro-organismen anders zijn dan S. aureus ze kunnen citraat afbreken en plasma doen stollen. In dit geval is het raadzaam om een Gram- en een catalase-test te doen..
-Het is belangrijk om bij de buistest de reactie elke 30 minuten te controleren, omdat er spanningen zijn S. aureus Ze produceren hoge concentraties fibrinolysine en zullen het nieuw gevormde stolsel snel verdunnen. Vermijd valse negatieven.
-Vermijd bij het volgen van de test de sonde hard te schudden, dit kan het begin van stolselvorming vernietigen die later niet zal worden hersteld, waardoor vals-negatieven ontstaan.
Niemand heeft nog op dit artikel gereageerd.