Voges-Proskauer test basisprincipes, voorbereiding en gebruik

854
Philip Kelley

De Voges-Proskauer-test is een biochemische test die wordt gebruikt om bacteriën te identificeren die tot de Enterobacteriaceae-familie behoren. Het is vooral handig voor het onderscheiden van stammen van Escherichia coli van Klebsiella en Enterobacter, onder andere.

De test wordt uitgevoerd in een vloeibaar kweekmedium genaamd Methyl Red-Voges Proskauer, beter bekend onder de afkorting RM / VP. Dit medium is samengesteld uit gebufferd polypepton, glucose, dikaliumfosfaat en gedestilleerd water..

Methyl Red-Voges Proskauer (RM / VP) Commercieel medium / VP Test respectievelijk positief en negatief. Bron: foto gemaakt door de auteur MSc. Marielsa Gil / Sudipta.nov15 [CC BY-SA 3.0 (https://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0)], van Wikimedia Commons

Het huidige RM / VP-medium is een modificatie van het Clark en Lubs-medium, dat oorspronkelijk een lagere concentratie peptonen en glucose bevatte. Daarom werd minder van het waterstofion geproduceerd dat nodig was voor de positieve Voges-Proskauer-reactie..

De test is gebaseerd op het vermogen van het micro-organisme om glucose te gebruiken via de butyleenglycolroute en een neutraal eindproduct te vormen, acetoïne genaamd, in aanwezigheid van zuurstof en een alkalische pH..

In het RM / VP-medium kan niet alleen de Voges-Proskauer-test worden onthuld, maar ook de methylrood-test.

Artikel index

  • 1 Grondgedachte
    • 1.1 Basis van de Voges-Proskauer-test
    • 1.2 Basis voor openbaarmaking van bewijs en interpretatie
  • 2 Voorbereiding
    • 2.1 Middelgrote MR / VP
    • 2.2 Reagens Voges A
    • 2.3 Reagens Voges B
  • 3 Voges-Proskauer testprocedure
    • 3.1 Ontwikkeling van de test
  • 4 Gebruik
  • 5 Kwaliteitscontrole
  • 6 referenties

Basis

Voges-Proskauer testbasis

De pluripeptonen die in het medium aanwezig zijn, voorzien in de essentiële voedingsbehoeften voor bacteriegroei. Glucose is van zijn kant de belangrijkste verbinding. Veel bacteriën kunnen glucose metaboliseren en pyrodruivenzuur vormen.

Pyrodruivenzuur is een middelpunt in het glucosemetabolisme en van daaruit kan elk micro-organisme verschillende routes volgen. Sommige zullen gemengde zuren vormen, zoals melkzuur, azijnzuur, mierenzuur en barnsteenzuur, en andere zullen neutrale producten vormen zoals 2,3-butaandiol..

De Voges-Proskauer-test toont het vermogen van het micro-organisme aan om onder aërobe omstandigheden acetylmethylcarbinol (acetoïne) te vormen, een tussenproduct van 2,3-butaandiol..

Acetoïne wordt gereduceerd en vormt 2,3-butaandiol, maar deze reactie is omkeerbaar, dus als 2,3-butaandiol wordt geoxideerd, wordt acetoïne gevormd. Daarom is zuurstof essentieel.

Dikaliumfosfaat is de buffer die het mengsel buffert tot pH 6,9 ± 0,2.

Openbaarmaking van bewijs en interpretatiebasis

Om de reactie aan te tonen, moet een ontwikkeling worden uitgevoerd met behulp van twee reagentia (Barrit-reagentia), bekend als Voges A en Voges B.

Voges A is een 5% -oplossing van α-naftol en Voges B is een 40% kaliumhydroxidepreparaat. Als kaliumhydroxide niet beschikbaar is, kan het worden vervangen door 40% natriumhydroxide.

Α-naftol is een katalysator die de kleurintensiteit van de reactie verhoogt, waardoor de test gevoeliger wordt. De α-naftol moet altijd eerst worden toegevoegd, waarbij de buis wordt geschud zodat het medium in contact komt met de zuurstof. Op deze manier wordt het aanwezige acetoïne geoxideerd tot diacetyl en wordt 2,3-butaandiol geoxideerd om acetoïne te vormen, dat dit doorgeeft aan diacetyl..

Dit is hoe α-naftol zich zal binden aan diacetyl, dat zich op zijn beurt heeft aangesloten bij de guanidinekern die aanwezig is in het aminozuur arginine, de laatste afkomstig van pluripeptonen..

Kalium- of natriumhydroxide van zijn kant is verantwoordelijk voor de opname van COtwee en om te reageren met peptonen. Deze reactie veroorzaakt de vorming van een zalmroze kleur, duidelijk zichtbaar na goed schudden van de buis..

De juiste hoeveelheden diacetyl, pepton en α-naftol moeten worden gemengd om de kleur onmiddellijk te laten ontstaan. Gebeurt dit niet, dan mag de sonde 15 minuten rusten alvorens te tolken..

Meestal is de test positief na 2 tot 5 minuten, wanneer een vage roze kleur te zien is. Als je het 30 minuten tot 1 uur laat rusten, is de intensiteit van de kleur maximaal (intens rood).

Een negatieve test zal verschijnen wanneer de bouillon geel wordt. Als de test negatief is, kan na 1 uur een koperkleur ontstaan ​​als gevolg van de reactie van kaliumhydroxide op α-naftol.

Voorbereiding

Middelgrote MR / VP

Weeg 17 g van het gedehydrateerde kweekmedium af en los op in een liter gedestilleerd water. Laat 5 minuten staan. Verwarm aan de kook om volledig op te lossen. Serveer 3 tot 4 ml in buisjes en steriliseer gedurende 15 minuten in autoclaaf bij 121 ° C.

Het gedehydrateerde kweekmedium is beige van kleur en het bereide medium is licht amberkleurig..

De uiteindelijke pH van het medium is 6,9 ± 0,2.

Reagens Voges A

Weeg 5 g α-naftol af en los op in 50 ml ethylalcohol (absoluut). Voeg vervolgens ethylalcohol toe tot 100 ml..

Voges B-reagens

Weeg 40 g kaliumhydroxide af en los op in 50 ml gedestilleerd water in een bekerglas. Het glas moet in een koudwaterbad worden geplaatst om de temperatuur te regelen, want als het preparaat is opgelost, stijgt de temperatuur sterk.

Nadat de oplossing is afgekoeld, wordt deze overgebracht naar een maatkolf en met gedestilleerd water aangevuld tot 100 ml..

Voges-Proskauer testprocedure

Om de Voges-Proskauer-test uit te voeren, wordt een RM / VP-bouillon gedurende 18 tot 24 uur geïnoculeerd met het micro-organisme dat wordt bestudeerd, uit een zuivere cultuur..

Het inoculum mag niet erg dicht zijn. Het wordt gedurende 24 tot 48 uur bij 35-37 ° C geïncubeerd, hoewel incubatie gedurende meerdere dagen soms noodzakelijk is. Cowan en Steel zijn van mening dat 5 dagen de minimale incubatietijd is die nodig is om alle positieve Voges-Proskauer (VP) -soorten van de Enterobacteriaceae-familie te detecteren..

Test ontwikkeling

Scheid een aliquot van 1 ml in een buis en ontwikkel het als volgt: plaats 12 druppels (0,6 ml) Voges A-reagens en 4 druppels (0,2 ml) Voges B. Meng om te beluchten en laat 5 - 10 minuten rusten alvorens te interpreteren. Als de test echter nog steeds negatief is, laat hem dan staan ​​en observeer de buis na 30 minuten tot 1 uur..

Het verschijnen van een rozerode kleur geeft aan dat de Voges-Proskauer-reactie positief is. Als het medium geel blijft, is de reactie negatief.

Het toevoegen van ontwikkelaars in de aangegeven volgorde en hoeveelheid is essentieel om valse negatieven te voorkomen..

Gebruik

De Voges-Proskauer-test is nuttig om onderscheid te maken tussen stammen van E coli die VP-negatief zijn, van onder andere de geslachten Klebsiella, Enterobacter, Serratia, die VP-positief zijn.

Bron: Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Microbiologische diagnose. 5e druk. Redactioneel Panamericana S.A. Argentinië.

QA

Controlestammen kunnen worden gebruikt om de kwaliteit van het bereide medium te testen, inclusief Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Proteus mirabilis ATCC 43071, Salmonella typhimurium en Enterobacter cloacae ATCC 13047.

Verwachte resultaten zijn alleen voor positieve Voges-Proskauer-reacties K. pneumoniae Y E. cloacae. De rest geeft negatieve reacties.

Referenties

  1. Britannia Laboratories. MR-VP Medium. 2015 Beschikbaar op: www.britanialab.com
  2. Microkit Laboratoria. M-Ident Voges Proskauer. 2014 Beschikbaar: http://www.medioscultivo.com
  3. Mac Faddin J. (2003). Biochemische tests voor de identificatie van bacteriën van klinisch belang. 3e ed. Redactioneel Panamericana. Buenos Aires. Argentinië.
  4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott Microbiologische diagnose. 12 ed. Redactioneel Panamericana S.A. Argentinië.
  5. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Microbiologische diagnose. 5e druk. Redactioneel Panamericana S.A. Argentinië.

Niemand heeft nog op dit artikel gereageerd.