De endonucleasen het zijn enzymen die de fosfodiësterbindingen in de nucleotideketen doorsnijden. Endonuclease-restrictiesites zijn zeer gevarieerd. Sommige van deze enzymen snijden het DNA (deoxyribonucleïnezuur, ons genetisch materiaal) bijna overal af, dat wil zeggen, ze zijn niet-specifiek.
Daarentegen is er een andere groep endonucleasen die zeer specifiek zijn in het gebied of de sequentie die ze moeten splitsen. Deze groep enzymen staat bekend als restrictie-enzymen, en ze zijn erg nuttig in de moleculaire biologie. In deze groep hebben we de bekende enzymen Bam HI, Eco RI en Alu I.
In tegenstelling tot endonucleasen zijn er een ander type katalytische eiwitten - exonucleasen - die verantwoordelijk zijn voor het verbreken van de fosfodiësterbindingen aan het einde van de keten..
Artikel index
Restrictie-endonucleasen of restrictie-enzymen zijn katalytische eiwitten die verantwoordelijk zijn voor het splitsen van de fosfodiësterbindingen in de DNA-keten in zeer specifieke sequenties.
Deze enzymen kunnen worden gekocht bij meerdere biotechnologiebedrijven en het gebruik ervan is bijna essentieel binnen de huidige DNA-manipulatietechnieken..
Restrictie-endonucleasen worden genoemd met de eerste letters van de binominale wetenschappelijke naam van het organisme waar ze vandaan komen, gevolgd door de stam (dit is optioneel) en eindigend met de groep van restrictie-enzymen waartoe ze behoren. BamHI en Eco RI zijn bijvoorbeeld algemeen gebruikte endonucleasen..
Het DNA-gebied dat het enzym herkent, wordt de restrictieplaats genoemd en is uniek voor elk endonuclease, hoewel verschillende enzymen op de restrictieplaatsen kunnen samenvallen. Deze site bestaat doorgaans uit een korte palindrome sequentie van ongeveer 4 tot 6 basenparen lang, zoals AGCT (voor Alu I) en GAATTC voor Eco RI..
Palindrome sequenties zijn sequenties die, hoewel ze in de richting 5 'naar 3' of 3 'naar 5' worden gelezen, identiek zijn. In het geval van Eco RI is de palindrome sequentie bijvoorbeeld: GAATTC en CTTAAG.
Gelukkig voor moleculair biologen hebben bacteriën in de loop van de evolutie een reeks restrictie-endonucleasen ontwikkeld die genetisch materiaal intern fragmenteren..
In de natuur hebben deze enzymen zich - vermoedelijk - ontwikkeld als een bacterieel beschermingssysteem tegen de invasie van vreemde DNA-moleculen, zoals die van fagen..
Om onderscheid te maken tussen natief en vreemd genetisch materiaal, kunnen deze restrictie-endonucleasen specifieke nucleotidesequenties herkennen. DNA dat deze sequentie niet heeft, kan dus ongestoord in de bacterie blijven..
Als het endonuclease daarentegen de restrictieplaats herkent, bindt het zich aan het DNA en snijdt het af..
Biologen zijn geïnteresseerd in het bestuderen van het genetisch materiaal van levende wezens. DNA bestaat echter uit een lengte van enkele miljoenen basenparen. Deze moleculen zijn extreem lang en moeten in kleine fragmenten worden geanalyseerd..
Om dit doel te bereiken, worden restrictie-endonucleasen geïntegreerd in verschillende moleculaire biologieprotocollen. Een individueel gen kan bijvoorbeeld worden vastgelegd en gerepliceerd voor toekomstige analyse. Dit proces wordt het "klonen" van een gen genoemd..
Polymorfismen met restrictiefragmentlengte verwijzen naar het patroon van specifieke nucleotidesequenties in DNA die restrictie-endonucleasen kunnen herkennen en knippen.
Dankzij de specificiteit van de enzymen wordt elk organisme gekenmerkt door een specifiek patroon van snijden in het DNA, afkomstig van fragmenten met variabele lengtes.
Historisch gezien zijn restrictie-endonucleasen geclassificeerd in drie soorten enzymen, aangeduid met Romeinse cijfers. De laatste tijd is een vierde type endonuclease beschreven.
Het belangrijkste kenmerk van type I endonucleasen is dat het eiwitten zijn die uit verschillende subeenheden bestaan. Elk van deze functioneert als een enkel eiwitcomplex en heeft gewoonlijk twee subeenheden genaamd R, twee M en één S..
Het S-gedeelte is verantwoordelijk voor de herkenning van de restrictieplaats in DNA. De R-subeenheid, van zijn kant, is essentieel voor splitsing en M is verantwoordelijk voor het katalyseren van de methyleringsreactie..
Er zijn vier subcategorieën van type I-enzymen, bekend onder de letters A, B, C en D, die algemeen worden gebruikt. Deze classificatie is gebaseerd op genetische complementatie.
Type I-enzymen waren de eerste restrictie-endonucleasen die werden ontdekt en gezuiverd. De meest bruikbare in de moleculaire biologie zijn echter type II, dat in de volgende sectie zal worden beschreven..
Type II restrictie-endonucleasen herkennen specifieke DNA-sequenties en splitsing op een constante positie nabij een sequentie die 5'-fosfaten en 3'-hydroxylen produceert. Ze hebben over het algemeen magnesiumionen nodig (Mgtwee+), maar er zijn er enkele die veel specifiekere vereisten hebben.
Structureel kunnen ze verschijnen als monomeren, dimeren of zelfs tetrameren. Recombinante technologie maakt gebruik van type II endonucleasen en om deze reden zijn meer dan 3.500 enzymen gekarakteriseerd.
Deze enzymsystemen bestaan uit twee genen, genaamd mod Y rundvlees, die code voor de subeenheden die DNA herkennen en voor wijzigingen of beperkingen. Beide substeden zijn nodig voor beperking, een proces dat volledig afhankelijk is van ATP-hydrolyse..
Om het DNA-molecuul te splitsen, moet het enzym een interactie aangaan met twee kopieën van de niet-palindrome herkenningssequentie en moeten de plaatsen in een omgekeerde oriëntatie op het substraat zijn. Splitsing wordt voorafgegaan door een DNA-translocatie.
Er is onlangs een extra groep geïdentificeerd. Het systeem bestaat uit twee of meer genen die coderen voor eiwitten die alleen gemodificeerde DNA-sequenties splitsen, gemethyleerd, gehydroxymethyleerd of gehydromethyleerd glucosyl..
Het enzym EckKMcrBC herkent bijvoorbeeld twee dinucleotiden van de algemene vorm RmC; een purine gevolgd door een gemethyleerd cytosine, dat kan worden gescheiden door verschillende basenparen - van 40 tot bijna 3000. Splitsing vindt plaats ongeveer 30 basenparen achter de plaats die het enzym herkent.
Endonucleasen van dit type worden ook wel endonucleasen genoemd "homingDeze enzymen herkennen en knippen de doelwit-DNA-sequentie op unieke plaatsen in het genoom van 14 tot 40 bp.
Deze enzymen worden vaak gecodeerd in introns en er wordt aangenomen dat hun functie het bevorderen van horizontale overdracht van de geknipte sequenties is. Na het knippen vindt een afbraakherstel plaats in de dubbele DNA-helix op basis van de complementaire sequentie.
Endonuclease I van E coli het fungeert als een verdedigingssysteem tegen fagen en parasieten. Het bevindt zich voornamelijk tussen het cytoplasmatische membraan en de celwand. Produceert dubbelstrengs breuken in het vreemde DNA waarmee het interageert in de periplasmatische ruimte.
CRISPR-Cas-endonucleasen zijn enzymen die inwerken op het afweermechanisme van veel soorten bacteriën. Deze identificeren en knippen specifieke DNA-sequenties van binnendringende organismen, die over het algemeen virussen zijn.
Onlangs ontdekten onderzoekers van het Massachusetts Institute of Technology (MIT) het CRISPR-Cas12bm genoombewerkingssysteem met hoge precisie voor de modificatie van menselijke cellen.
Niemand heeft nog op dit artikel gereageerd.