De proteïnase K Het is een enzym dat behoort tot de groep van serineproteasen, dat wil zeggen, het heeft een aminozuur serine in zijn actieve katalytische centrum en heeft de functie om peptidebindingen te verbreken door hydrolyse. Dit enzym behoort op zijn beurt tot de familie van subtilisine-eiwitten (peptidase S8).
Proteinase K heeft een molecuulgewicht (MW) van 28.900 dalton en werd voor het eerst geïsoleerd in 1974 in extracten van de schimmel Engyodontium album, voorheen bekend als Tritirachium album Limber.
Het heeft een hoge proteolytische capaciteit, wat blijkt uit het feit dat het de aanwezige keratine in het haar kan afbreken. Het woord keratine in het Engels is geschreven "keratine", daarom wordt het "proteïnase K" genoemd.
Vanwege zijn hoge vermogen om natuurlijke eiwitten te splitsen, is dit enzym nuttig in verschillende moleculaire biologietechnieken. Hoofdzakelijk gebruikt voor het isoleren en bereiden van nucleïnezuren met een hoog molecuulgewicht (MW).
Proteinase K werkt door nucleair DNA vrij te maken, terwijl het eiwitten vernietigt en RNases en DNases inactiveert, dat wil zeggen, het elimineert nucleasen in DNA- en RNA-preparaten..
Aan de andere kant is gezien dat proteïnase K sommige gedenatureerde natuurlijke eiwitten kan hydrolyseren, wat de interesse van onderzoekers heeft gewekt voor het gebruik ervan bij de studie van prioneiwitten (PrPC)..
Ondanks hun hoge proteolytische potentie zijn er echter eiwitten die resistent zijn tegen de werking van proteïnase K. Onder hen bevinden zich enkele abnormale eiwitten, prionen (PrPSc) genaamd, die geassocieerd zijn met overdraagbare spongiforme encefalopathieën..
Artikel index
Proteinase K heeft een tertiaire structuur die bestaat uit drie lagen, met een β-plaat van zeven ketens tussen twee lagen helices. Omdat het tot de S8-familie van peptidasen behoort, wordt het gekenmerkt door een katalytische triade op zijn actieve plaats, waarvan de opeenvolgende volgorde (Asp, His en Ser) is, waardoor ze zich onderscheiden van andere families van peptidasen..
Dit enzym uit de groep van serineproteasen wordt gekenmerkt door het hydrolyseren van de peptidebindingen nabij de carboxylgroep van alifatische en aromatische aminozuren..
Aan de andere kant is het in staat om te werken in de aanwezigheid van bepaalde corrosieve stoffen, zoals natriumdodecylsulfaat (SDS), Tris-HCL en EDTA, die worden gebruikt om de denaturatie van eiwitten te helpen, waardoor ze hun oorspronkelijke structuur verliezen. ..
Dit is een voorbereidende stap bij de bereiding van eiwitten voor de elektroforesetechniek. Het pH-bereik waarbij proteïnase K werkt, is vrij breed (2,0 tot 12,0), met een optimale pH tussen 7,5 en 12,0, en het iso-elektrische punt is 8,9. Zoals te zien is, is het actief tegen een zeer breed pH-bereik..
Een ander kenmerk dat opvalt aan proteïnase K is de stabiliteit bij hoge temperaturen (50 - 60 ° C)..
Proteinase K vereist de aanwezigheid van het calciumion, hoewel dit zijn activiteit niet beïnvloedt, als het essentieel is om zijn stabiliteit te behouden.
Om proteïnase K het substraat volledig te laten verteren, is een contacttijd van ongeveer 5 minuten tot 2 uur nodig..
In deze zin vergeleken Daza et al. Echter de zuiverheid van het DNA dat bij verschillende blootstellingstijden werd verkregen tegen proteïnase K, en concludeerden dat een langdurige incubatie (tot 24 uur) de kwaliteit van het DNA aanzienlijk verbetert..
Nu, met betrekking tot de concentratie van het proteinase K-enzym dat in de verschillende protocollen wordt gebruikt, kan worden gezegd dat het zeer gevarieerd is.
Het kan worden gebruikt vanaf zeer lage concentraties (5 µg / ml) tot concentraties van 500 µg / ml. Maar de meest voorkomende werkconcentraties variëren van 50-100 μg / ml, vooral voor eiwitvertering en nuclease-inactivering. Hoewel voor de behandeling van weefsels een concentratie van 2 mg / ml vereist is.
De toepassingen zijn zeer breed en kunnen als volgt worden samengevat:
-Het wordt gebruikt bij de vertering van eiwitten en DNA-extractie met verschillende methoden zoals: uitzouten, PK-SDS, cetyl-trimethylammoniumbromide (CTAB), gemodificeerd kaliumacetaat en extractie met natriumjodide..
-Nuclease-inactivering (RNases en DNases).
-In de hybridisatietechniek in situ (HIS), om de afgifte van nucleïnezuren te bevorderen, naast het verwijderen van ongewenste eiwitten.
-Eiwitmodificatie.
-Op onderzoeksniveau, in verschillende onderzoeken.
Er zijn verschillende vergelijkende onderzoeken uitgevoerd tussen DNA-extractietechnieken die Proteinase K gebruiken, met andere die het niet gebruiken en ze concluderen allemaal dat er grotere voordelen zijn bij het gebruik van het enzym. Voordelen zijn onder meer:
-DNA met een hoog moleculair gewicht, hoge kwaliteit en zuiverheid wordt verkregen.
-Het geëxtraheerde DNA is tot 3 maanden stabiel.
Het geëxtraheerde DNA kan worden gebruikt in de volgende technieken: Southern blot, polymerasekettingreactie (PCR), elektroforese, onder andere..
Verschillende onderzoeken hebben geconcludeerd dat prionen (abnormale toxische PrPSc-eiwitten) verschillen van PrPC (natieve) eiwitten doordat ze resistent zijn tegen de werking van proteïnase K, terwijl PrPC's gevoelig zijn voor de werking ervan..
Andere auteurs hebben beschreven dat er in de structuur van PrPSc gevoelige delen zijn en andere die resistent zijn tegen proteïnase K. Beide delen zijn echter even toxisch en infectieus..
Aan de andere kant, Bastian et al.In 1987 isoleerden 4 eiwitten van 28, 30, 66 en 76 kda uit een soort van Spiroplasma mirum. Alle bleken resistent te zijn tegen de werking van proteïnase K en vertoonden ook een kruisreactie met enkele prionen..
Het is bekend dat deze soort cataracten en aanzienlijke neurologische schade kan veroorzaken en vanwege de wetenschappelijke bevindingen van Bastian, naast andere onderzoeken, is een poging gedaan om dit micro-organisme in verband te brengen met overdraagbare spongiforme encefalopathieën..
De etiologie van deze degeneratieve neurologische pathologie wordt echter nog steeds aan prionen toegeschreven..
In die zin identificeerden en karakteriseerden Butler et al. In 1991 een klasse van eiwitten die resistent zijn tegen proteïnase K van 40 kda van twee stammen van Mycoplasma hyorhinis. Deze ziekteverwekker treft varkens en infecteert hun weefsels, maar in dit geval was er geen kruisreactie met de geteste prionen..
Meer onderzoek is nodig om in dit opzicht veel onbekende factoren op te helderen.
Niemand heeft nog op dit artikel gereageerd.