De catalase-test is een methode die in bacteriologische laboratoria wordt gebruikt om de aanwezigheid van het catalase-enzym in die bacteriën die het bezitten, aan het licht te brengen. Samen met de Gram-kleuring zijn dit de belangrijkste tests die moeten worden uitgevoerd op nieuw geïsoleerde micro-organismen. Deze tests begeleiden de microbioloog bij de te volgen stappen voor de definitieve identificatie van het micro-organisme in kwestie..
In het algemeen bezitten bacteriën die cytochroom bevatten het enzym catalase, wat betekent dat facultatieve aërobe en anaërobe bacteriën het zouden moeten bezitten. Er zijn echter uitzonderingen, zoals Streptococcus, die ondanks het feit dat ze facultatief anaërobe micro-organismen zijn, niet het enzym catalase hebben..
Daarom wordt de catalase-test vooral gebruikt om de families Staphylococaceae en Micrococaceae (beide catalase-positief) te onderscheiden van de Streptococaceae-familie (catalase-negatief)..
Evenzo onderscheidt het geslacht Bacillus (catalase-positief) zich van het geslacht Clostridium (catalase-negatief), onder andere.
Artikel index
Catalase is een enzym dat is geclassificeerd als een hydroperoxidase, dit betekent dat ze waterstofperoxide (H.tweeOFtwee.
Het wordt ook als een oxidoreductase beschouwd, omdat er in de reactie waaraan het deelneemt een element is dat dient als een elektronendonor (reducerende stof) en een ander als een elektronenreceptor (oxiderende stof)..
Catalase is een eiwit dat een proserische groep bevat met vier driewaardige ijzeratomen (Fe+++), daarom is het een homoproteïne. Het ferri-ion blijft tijdens de reactie geoxideerd.
Er kan worden gezegd dat catalase een ontgiftend enzym is, omdat het als functie heeft om stoffen te elimineren die tijdens het metabolisme van bacteriën worden geproduceerd en die giftig zijn voor bacteriën. Een van deze stoffen is waterstofperoxide.
Waterstofperoxide wordt gevormd door de aëroob afbraak van suikers. Dit proces verloopt als volgt:
Het superoxide-ion (Otwee-) (vrije radicalen) wordt gevormd als het eindproduct van de opname van glucose via de aërobe route. Dit is giftig en wordt geëlimineerd door het enzym superoxide-dismutase dat het omzet in gasvormige zuurstof en waterstofperoxide.
Waterstofperoxide is ook giftig voor bacteriën en moet worden verwijderd. Het enzym catalase breekt waterstofperoxide af in water en zuurstof.
Catalase kan inwerken op andere substraten dan waterstofperoxide, zoals alcoholen, aldehyden, zuren, aromatische aminen en fenolen. Waterstofperoxide kan echter ook door katalase worden gebruikt om andere giftige verbindingen zoals methyl- en ethylalcohol te oxideren..
Evenzo is catalase aanwezig in fagocytische cellen en beschermt het tegen de giftige werking van waterstofperoxide..
3% waterstofperoxide (10 volumes).
Microscoopschuif
Wegwerp plastic handvat of houten tandenstoker.
Neem een voldoende hoeveelheid van de kolonie om te studeren zonder de agar aan te raken waaruit het afkomstig is. De kolonie moet vers zijn, dat wil zeggen van een cultuur van 18 tot 24 uur.
Plaats de kolonie op het droge glaasje en voeg daarop een druppel 3% waterstofperoxide toe (je kunt ook HtweeOFtwee 30%). Kijk onmiddellijk of er bellen vrijkomen of niet.
Positieve reactie: gasontwikkeling, blijkend uit de vorming van bellen (sterk borrelen).
Negatieve reactie: geen bellenvorming.
Plaats 1 ml H.tweeOFtwee 3% op een pure plaat of wigcultuur die geen bloed bevat (bij voorkeur voedingsagar). Observeer onmiddellijk of er al dan niet bellenvorming is. U kunt ook H gebruikentweeOFtwee 30%.
Het wordt op dezelfde manier geïnterpreteerd als de porta-objectmethode.
Vul een capillaire buis van 67 mm tot een hoogte van 20 mm met capillair 3% waterstofperoxide.
Raak de geïsoleerde kolonie die moet worden bestudeerd aan met het capillair vol met HtweeOFtwee om 3 uur%. Kijk of het capillair zich binnen ongeveer 10 seconden met bellen vult. Deze methode maakt een semi-kwantificering van de reactie in kruisingen mogelijk:
Geen kruisen, geen luchtbellen (negatieve reactie).
+ --Weinig bubbels (zwakke of vertraagde reactie).
++ -Overvloedige bubbels (matige reactie).
+++ -Bellen bereiken het andere uiterste (energetische reactie).
Plaats een geïsoleerde kolonie op een schone, droge dia en plaats vervolgens een druppel H.tweeOFtwee 0,5% en dek af met een dekglaasje. Kijk of er al dan niet opgesloten bellen worden gevormd.
Interpretatie: de aanwezigheid van bellen duidt op een positieve reactie. Geen bellen, het wordt geïnterpreteerd als een negatieve reactie.
Deze techniek moet worden gedaan door de pH en temperatuur te regelen. Het moet worden uitgevoerd onder een kap met laminaire stroming, aangezien manipulatie van de verschillende Mycobacterium-soorten gevaarlijk is.
Waterstofperoxide 30% of 110 volumes (superoxal).
Fosfaatbuffer pH 7
10% Tween 80
Mycobacterium wigcultuur gedurende 3 tot 4 weken
Wegen:
1,361 g (KHtweePO4) watervrij monokaliumfosfaat.
1.420 g watervrij dinatrium (Na2HPO3) fosfaat.
Los beide zouten op in een beetje steriel gedestilleerd water en vul aan met water tot 1000 ml.
Maak een 1:10 verdunning tot de Tween 80 die commercieel geconcentreerd is, ga hiervoor als volgt te werk:
Neem 1 ml Tween 80 en doe het in een beetje gedestilleerd water, los op en vul aan met water tot 10 ml.
Meng een hoeveelheid fosfaatbuffer met een hoeveelheid van 10% Tween 80 (in gelijke delen). Bepaal in het laboratorium hoeveel u wilt bereiden.
Plaats 5 ml fosfaatbuffer in een steriele reageerbuis met schroefdop (bakeliet).
Neem met een inoculatielus voldoende kolonie van een Mycobacterium-groei, gezaaid in wiggen en los op in de fosfaatbuffer.
Sluit de buis af zonder de schroefdraad te strak aan te spannen. Plaats gedurende 20 tot 30 minuten in een waterbad van 68 ° C. Verwijder en laat afkoelen tot 22-25 ° C
Meet 0,5 ml van het laatste reagens (mix) af en voeg dit toe aan de buis met de koude oplossing. Let op de vorming van bellen of niet.
Het wordt op dezelfde manier geïnterpreteerd als de vorige technieken.
Wanneer koloniegroei wordt verkregen in verrijkte media, moet een Gram-kleuring en een catalase-test worden uitgevoerd op de verkregen kolonies. Dit zal de microbioloog begeleiden bij de te volgen procedures voor definitieve identificatie..
Om de goede prestatie van het waterstofperoxidereagens te beoordelen, gebruikt u vers gekweekte controlestammen, zoals Staphylococcus aureus als een positieve controle en stammen van Streptococcus sp als negatieve controle.
Een ander alternatief dat als positieve controle dient, is om een druppel waterstofperoxide op de bloedagar te plaatsen, de erytrocyten hebben catalase, daarom zal er een borrel zijn als het reagens in goede staat is..
Een chocolade-agar kan als negatieve controle worden gebruikt, hier zijn de erytrocyten al gelyseerd en is de test negatief.
-Gebruik geen oude culturen voor de test, omdat dit kan leiden tot fout-negatieven.
-Vermijd het nemen van kolonies uit bloedagar-culturen, als u voorzichtig bent om de agar niet aan te raken; deze procedure kan leiden tot valse positieven, aangezien erytrocyten catalase bevatten.
-Als u de platina-cologne gebruikt, draai de volgorde van de procedure dan niet om, omdat dit kan leiden tot valse positieven. Dit komt omdat platina in staat is om te reageren met waterstofperoxide, waardoor het gaat borrelen..
-Gebruik het waterstofperoxide-reagens niet als het erg oud is, aangezien het reagens erg onstabiel is en na verloop van tijd de neiging heeft af te breken..
-Bewaar het waterstofperoxidereagens beschermd tegen licht en gekoeld om schade te voorkomen..
-Voer elke keer dat het wordt gebruikt een kwaliteitscontrole uit op het waterstofperoxidereagens.
-Houd er rekening mee dat als de HtweeOFtwee bij 30% zijn de reacties sterker dan die uitgevoerd met HtweeOFtwee om 3 uur%.
Niemand heeft nog op dit artikel gereageerd.